İstanbul'un Eyüp semtinde doğan, dedesi Feshane işçilerinden sayacı bir usta, babası da işçi olan İşler, ilkokuldan sonra eğitimine Cağaloğlu Anadolu Lisesi'nde devam etti. İşler soyadını dedesinin işinden aldığını söylemiştir. Ortamına alışamadığı yeni okulunda popüler olmak ve derslerinden kaçmak için okulun tiyatro koluna girdi. Kısa zamanda popüler olan Nejat İşler derslerini de boşluyordu. Liseyi bitirdikten sonra üniversiteye giremeyince, para kazanmak için çay partileri düzenlemeye başladı. Nejat'ın parti organizasyonlarında işleri umduğu gibi gitmeyince borca girdi. Borçlarını kapatabilmek için Mahmutpaşa'dan T-shirt alıp Teşvikiye'de bu T-shirtleri satma kararı aldı. Kış aylarında ise T-shirt yerine kitap, dergi ve plak sattı.

İki sene sonra Yıldız Teknik Üniversitesi Fotoğraf bölümünü kazanan Nejat İşler, askerlik için bölümü okumaktan vazgeçti.

27 Mart Dünya Tiyatrolar Günü'nde Taksim'de dolaştığı bir gün, bir tiyatro sahnesinde bedava gösterimde olan "Danton'un Ölümü" adlı eseri seyretti. "Ben niye bu işi yapmıyorum?" diye düşünen Nejat İşler, dayısının yanına gittiği Eskişehir'de konservatuvar sınavına girmeye karar verdi. İstanbul'a döndüğünde, 1991 yılında  ilanını gördüğü Mimar Sinan Üniversitesi Konservatuvar Bölümüne başvurdu ve kazandı. 1995 yılında Mimar Sinan Üniversitesinin devlet konservatuvar bölümünden mezun olana kadar devlet tiyatrosunda ve televizyon dizilerinde rol aldı. Bu dönemde de CD ve kitap sattığı işporta tezgahını işletmeye devam etti.

1995 yılında mezun olduktan sonra iki arkadaşıyla birlikte "Kahramanlar ve Soytarılar Tiyatrosu"nu kurdu. Tiyatronun kurulmasından sonra kendi oyunları için hikâyeler yazmaya başladı. "Belki hiç okumayan biri de yazabilir bunları, benim yazı yazmamın nedeni yazmak değil, sadece oynayalım diye yazıyorum." dediği, "Tuhaf Şehir Hikayeleri", "Biz Zavallı Erkekler" ve "Yalnızlık Benim Gizli Sevgilim" adlı üç kitap yazdı.

41.Antalya Altın Portakal Ödülleri için Erkek Oyuncu dalında aday olarak gösterildi. Her fırsatta amacının başrol oynayıp şöhret olmak olmadığını belirten İşler, tek arzusunun yaptığı işi elinden geldiğinin en iyisi olarak yapmak olduğunu, tiyatro yaparken ölmek istediğini dile getirdi.

1994 yılında rol aldığı ilk televizyon dizisi olan Gurur'dan sonra, Deli Yürek, Şehnaz Tango, Nasıl Evde Kaldım, Dedem, Gofret ve Ben, Aşk ve Gurur, Şeytan Ayrıntıda Gizlidir dizilerinde oynadı. Asıl popülerliğini ise Gülbeyaz ve Aliye adlı dizilerde yakalamıştır. 1999'da ilk sinema filmi Eylül Fırtınası'nda rol aldı. Mustafa Hakkında Herşey ve Anlat İstanbul filmleri ile sinema oyunculuğuna devam etti.

2006 yılında "Çalıntı Gözler", "Yaşamın Kıyısında" ve "İki Süper Film Birden", 2007 yılında ise "Barda" ve "Yumurta" gibi filmlerde rol aldı. 2007 yılının en popüler dizilerinden biri olan "Bıçak Sırtı" adlı televizyon dizisinde rol almıştır. 2009 sonbahar yayın döneminde başlayan Kapalıçarşı isimli dizide oynadı.2011 yılında "Kaybedenler Kulübü" adlı filmde başrol oynamış ve yine 2011 yılında Behzat Ç. Bir Ankara Polisiyesi dizisinde oynadığı bütün rollerden farklı olarak sıradışı bir seri katil olan Ercüment Çözer rolünü canlandırmıştır. Duman grubunun "Ah" parçasını coverlamıştır. Bunun yanında Suzan Kardeş'in Haluk Bilginer, Olgun Şimşek, Cem Yılmaz, Özgü Namal gibi isimlerin yer aldığı Suzan Kardeş & Makyaj Odası Şarkıları adlı albümünde yer almış ve Hancı adlı şarkıyı seslendirmiştir. Başrol olarak Kanal D'de yayınlanan Keşanlı Ali Destanı dizisinde başrolde Keşanlı Ali'yi canlandırmıştır.

En son olarak da Kanal D'de İntikam adlı dizide Rüzgar rolünü canlandırmış, ayrıldıktan sonra yerine Yiğit Özşener rol almıştır. Geçirdiği hastalık sonrasında sakin bir hayat sürmek isteyen Nejat İşler, Bodrum Gümüşlük'te Tezgah isimli bir sahaf dükkanı açmıştır.

2015'te Bodrum merkezli Gümüşlükspor kulübünün başkanlığına seçildi.

Hastalık dönemi
2013 yılının Eylül ayında Beren Saat ile birlikte başrolünü oynadığı İntikam adlı diziden sedef hastalığı nedeniyle ayrılarak Bodrum Gümüşlük'teki evine giden İşler, tedavi olmak istemediği yönündeki açıklamalar için facebook sayfasında şu açıklamayı yapmıştı:
“Tedaviyi reddetmek, erken ölmek gibi niyetim yok. Bazen cevabını kaldıramayacağını bilsen de yine de gerçeği öğrenmek istersin. Milyon tane kazık yiyince, bedenin zarar görüyor. Çıplak geldim, çıplak gideceğim. Amacım zamanı satın almak. Mülk edinmek gibi bir derdim yok. Mülkiyet hırsızlık gibi bir şey. Sevmiyorum işte. Biz kuşak olarak böyleyiz. Bize sevmeyi, bir şeylere bağlanmayı öğretmediler. O tarafımız gelişmedi. Ben dünyanın bir parçasıyım. Şurayla ve bedenimle sınırlı değilim. Bir şeyler yanlış gidiyor, birileri acı çekiyor. Ben de çekiyorum aynı acıyı. Altıma son model bir araba çekip, güzel bir ev alınca mutlu mu olacağım yani? Hayır, olmam. Aramızda mutlu olanlar varsa zekalarından şüphe ederim, bir de gözlerinden. Çünkü iyi görmüyorlardır. Siz beni yenmediniz çünkü: ben sizinle daha oynamadım. Ben gidiyorum dediğimde ‘gitme’ diyen birini değil, ‘Ben de geliyorum, yalnız gidemezsin’ diyen birini istiyorum.”

17 Ocak 2014 tarihinde hastaneye kaldırılarak yoğun bakım ünitesinde tedavi altına alındı. 22 Ocak 2014 tarihinde tedavi gördüğü Bodrum'daki hastaneden İstanbul'daki Acıbadem Maslak Hastanesi'ne nakledilmiştir.30 Ocak 2014 tarihinde doktorlar İşler'in konuşmaya başladığı bildirdi. 2014 yılı Nisan ayında Vehbi Koç Vakfı Amerikan Hastanesinden taburcu oldu.